Genexpression in den Hauptzelltypen der Gefäßwand. Einfluß koloniestimulierender Faktoren
Stefan Lorkowski
Inhalt
Inhaltsverzeichnis (I)
Abkürzungsverzeichnis (IV)1 Einleitung (1)
1.1 Der Aufbau der Arterienwand (1)
1.2 Arteriosklerose (2)
1.2.1 Das pathologische Erscheinungsbild der Arteriosklerose (2)
1.3 Untersuchte Zelltypen der arteriosklerotischen Läsion (3)
1.3.1 Endothelzellen (3)
1.3.2 Glatte Muskelzellen (4)
1.3.3 Makrophagen (6)
1.4 Kollagene (8)
1.4.1 Klassifizierung von Kollagenen (9)
1.4.2 Kollagen Typ VIII (11)
1.5 Zytokine, Wachstumsfaktoren und koloniestimulierende Faktoren 13)
1.5.1 Der Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierende
Faktor (14)2 Aufgabenstellung (17)
3 Materialien (18)
3.1 Geräte (18)
3.2 Chemikalien und Materialien (19)
3.3 Lösungen, Puffer und Medien (24)4 Methoden (37)
4.1 Kultivierung von Säugetierzellen (37)
4.1.1 Verwendete Säugerzellen und ihre Herkunft (37)
4.1.1.1 Porkine Endothelzellen (37)
4.1.1.2 Porkine glatte Muskelzellen (38)
4.1.1.3 Humane Monozyten/Makrophagen (38)
4.1.2 Isolierung und Primärkultur vaskulärer, porkiner Endothelzellen aus Aorten (38)
4.1.3 Kultivierung von porkinen glatten Muskelzellen aus Aorten (39)
4.1.4 Isolierung und Kultivierung humaner Monozyten (40)
4.1.5 Subkultivierung von Monolayer-Zellkulturen (41)
4.1.6 Induktionsversuche mit GM-CSF (41)
4.2 Charakterisierung der verwendeten Zellen (43)
4.2.1 Endothelzellen (43)
4.2.2 Glatte Muskelzellen (43)
4.3 Molekular- und mikrobiologische Arbeitsmethoden (48)
4.3.1 Isolierung der Gesamt-RNA (48)
4.3.1.1 Lyse der Zellen aus der Monolayer-Zellkultur (48)
4.3.1.2 CsCl-Zentrifugation (48)
4.3.1.3 Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration (49)
4.3.1.4 TBE-Agarose-Gelelektrophorese (50)
4.3.2 Northern-Blot-Analysen (50)
4.3.2.1 Denaturierende Gelelektrophorese (51)
4.3.2.2 Kapillarblot (51)
4.3.2.3 Hybridisierungsanalyse des RNA-Blots (54)
4.3.3 Nichtradioaktive REN-DDRT-PCR mit Silberfärbung (56)
4.3.3.1 Entfernen chromosomaler DNA aus RNA-Proben (60)
4.3.3.2 Reverse Transkription (61)
4.3.3.3 Polymerase-Kettenreaktion (61)
4.3.3.4 Auftrennung und Visualisierung von PCR-Fragenten (62)
4.3.3.4.1 Horizontale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (62)
4.3.3.4.2 Silberfärbung von Polyacrylamid-Gelen (64)
4.3.3.5 Elution und Reamplifikationen ausgewählter PCR-
Produkte (64)
4.3.3.5.1 Elution von Banden aus Polyacrylamid-Gelen (64)
4.3.3.5.2 Überprüfung der Reamplifikation (65)
4.3.3.5.3 Steigerung der DNA-Ausbeute durch Reamplifika-
tion (65)
4.3.3.5.4 Überprüfung der Reamplifikation im TBE-Agarose-
Gel (65)
4.3.3.5.5 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen (65)
4.3.3.6 Ligation und Transformation (66)
4.3.3.6.1 Ligation (66)
4.3.3.6.2 Transformation (68)
4.3.3.7 Kultivierung von Bakterien (69)
4.3.3.7.1 Anzucht von Bakterien (69)
4.3.3.7.2 Lagerung von Bakterien (69)
4.3.3.8 Isolierung von Plasmiden (69)
4.3.3.9 Restriktionsanalysen mittels Agarose-Gelelektrophorese (70)
4.3.3.10 DNA-Sequenzanalyse (73)
4.3.3.10.1 Alkalische Denaturierung und DNA-Fällung (74)
4.3.3.10.2 Annealing, Labeling und Sequenzierung (75)
4.3.3.10.3 Denaturierende Gelelektrophorese (75)5 Ergebnisse (77)
5.1 Zellkultur (77)
5.2 Immunmarkierungen (77)
5.3 Northern-Blot-Analysen (77)
5.3.1 Isolierung der Gesamt-RNA für Northern-Blot-Analysen (78)
5.3.2 Gelelektrophorese und Blot (78)
5.3.3 Densitometrische Auswertungen (80)
5.3.3.1 Porkine Endothelzellen (80)
5.3.3.2 Makrophagen (88)
5.4 Differential Display (89)
5.4.1 Isolierung der Gesamt-RNA für das Differential Display (89)
5.4.2 Reverse Transkription und PCR (90)
5.4.3 Gelelektrophorese (90)
5.4.4 Reamplifikation eluierter Banden (92)
5.4.5 Restriktionsanalysen (94)
5.4.6 Sequenzanalyse (95)6 Diskussion (97)
6.1 Charakterisierung der verwendeten Zellen (97)
6.2 Modulation der Genexpression durch GM-CSF (98)
6.2.1 Die Rolle von GM-CSF und Kollagen Typ VIII in der Arteriosklerose (98)
6.2.2 GM-CSF moduliert die Genexpression in vaskulären
Endothelzellen (102)
6.2.3 Einfluß von GM-CSF auf die Genexpression in Makro- phagen (104)
6.2.4 Stimulation der Genexpression durch GM-CSF in glatten Muskelzellen (106)
6.3 Ausblick (107)7 Zusammenfassung (109)
Literaturverzeichnis (A)
Anhang - Zusammensetzung der verwendeten Medien (X)
Danksagungen (Z)
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